microRNA在糖尿病肾病中作用的研究进展
糖尿病肾病（DN）是糖尿病患者最常见的微血管并发症。在欧美等发达国家，DN 已成为终末期肾病（ESRD）的首要病因。在我国，因DN 而最终导致ESRD 的比例也在逐年上升。DN 的早期诊断和合理的治疗可有效地延缓疾病进展。
因此，深入认识DN 的发病机制，并对其发病的关键环节进行干预，不仅可减轻疾病给患者带来的痛苦，对减轻国家在卫生经济费用方面的负担也有重要意义。
目前DN的发病机制仍未完全明确，近年有研究发现microRNA（miRNA）在基因中的调控作用可能成为DN一个新的诊断标志及治疗靶点。本文就miRNA在DN中的作用及相关机制进行综述。
miRNA的特点及作用机制
miRNA 是一种长约21～25 个核苷酸的非编码单链RNA。miRNA 与RNA 诱导的基因沉默复合物(RNA ?induced silencing complex，RISC)结合并形成非对称RISC复合物后被激活。
通过结合至靶基因mRNA 上，非对称RISC 复合物可促进mRNA 的降解或抑制mRNA 的翻译，从而抑制其靶基因的表达，实现对靶基因的转录后调控。
根据序列互补程度分类，目前已知的miRNA 对靶基因的负性调控作用主要通过两种方式：一种是miRNA 与靶基因mRNA 不完全互补。
此方式主要在翻译水平上抑制靶基因mRNA 的表达，并可影响mRNA 的稳定性，这类miRNA 的结合位点通常在靶基因mRNA 的3’端非翻译区，而绝大多数哺乳动物中的miRNA 通过这一方式发挥调控作用。
另一种是miRNA 与靶基因mRNA 完全互补。此方式可引起mRNA 的直接降解，这类miRNA 的结合位点通常都在靶基因mRNA的编码区或开放阅读框中。
据推测，人类基因组中3%为miRNA，而30%编码蛋白质的mRNA受其调控。由于miRNA在细胞增殖、分化及能量代谢方面起着重要作用，其异常表达可影响肿瘤、心血管疾病及代谢性疾病的发生发展。
随着miRNA在各种疾病发生机制中作用研究的深入，miRNA 在疾病中的诊断价值越来越受到重视，而基于miRNA 为靶点的基因治疗也展现出广阔的发展前景。
糖尿病肾病与miRNA
高血糖状态是DN 发生发展的关键环节，由高血糖引起的葡萄糖代谢异常及肾脏血流动力学改变是肾脏病变的基础，而各种细胞因子的激活则是病变的直接诱因。
其中，包括系膜细胞、足细胞及肾小球上皮细胞等肾脏多种细胞的损伤，均参与了肾小球硬化的过程。通过miRNA 表达谱芯片（microarray）及各种体内外实验发现，miRNA 在肾脏各种细胞损伤中起着不同作用。现将各种miRNA在高糖状态下不同细胞中的作用及相关机制分述如下。
miRNA与肾小球系膜细胞
目前认为，作为肾小球最主要的细胞之一——肾小球系膜细胞在高糖状态下的变化，即系膜细胞肥大及细胞外基质（ECM）沉积，是DN 最重要的特征。在此过程中，高糖诱导的转化生长因子β（TGF?β）升高是启动因素，并通过激活ERK1/2、PI3K 及JNK?MAP 激酶信号通路促进细胞肥大及胶原蛋白表达。
miR?192：Kato 等首次发现，在TGF?β诱导下的小鼠系膜细胞中，miR?192 的表达增高，而miR?192 可抑制锌指E盒结合蛋白1（zinc finger E?box binding homeobox 1，ZEB1）及锌指E 盒结合蛋白2（zinc finger E?box bindinghomeobox 2，ZEB2）的表达。
作为E?box 的抑制子，ZEB1/2的减少可引起E?box的上调，继而导致下游Ⅰ型胶原蛋白α2（type Ⅰ collagen α2，Col1α2）沉积。在STZ 诱导的1 型糖尿病小鼠以及2型糖尿病模型db/db小鼠的肾脏中也有同样结果。
miR-216a 及miR-217：E-box 作为一种重要的调控元件，可调控多种基因的表达。miR?216a及miR?217位于非编码RNARP23?298H6.1?001（RP23）的第二内含子上。E?box 的上调可促进miR?216a 及miR?217 的表达，继而下调磷酸酶张力蛋白同系物（phosphatase and tensinhomologue，PTEN），激活PI3K?Akt 信号通路。
Akt 激酶激活可通过使多种下游蛋白，包括TOR、GSK?3β及FoxO转录因子磷酸化而调控细胞生长、存活及蛋白质合成。这些转录因子的激活最终可引起系膜细胞肥大、氧化应激等而促进DN的进展。
此外，Kato等还发现，miR?216a可抑制Ybx1（一种Tsc?22 mRNA 结合蛋白），使Tsc?22 蛋白增加，促进TGF?β诱导的系膜细胞Col1α2的表达。
miR?200 家族：除了调控miR?216a 及miR?217 以外，E?box 的结合位点同时也存在于miR?200 家族（包括miR?141、?200a、?200b、?200c、?429）上游基因组区域，其上调可增加miR?200 家族的表达。
而miR?200 家族的增加可通过作用于下游蛋白Fog2，降低Fog2 对PI3K 的抑制，激活PI3K?Akt信号通路。
miR?377：在STZ 诱导1 型糖尿病小鼠及高糖状态下的人系膜细胞中，Wang 等也发现了miR?377 高表达。同时，在实验中证实了其通过下调锰超氧化物歧化酶（manganese superoxide dismutase，MnSOD）及p21 活化激酶（PAK1），增加纤连蛋白（FN）的表达。而FN是引起DN肾小球ECM沉积的主要蛋白之一。
miR?21：Dey 等研究发现，miR?21 在高糖培养的大鼠及人肾小球系膜细胞中高表达，而在OVE26 1 型糖尿病小鼠模型及UUO 肾间质纤维化大鼠模型中同样升高。与此同时，其靶基因PTEN 的表达减少，并伴有系膜细胞肥大，FN 增加。
miR?21 过表达可模拟高糖作用，抑制PTEN 表达，增加磷酸化丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶B（phospho? serine/ threonine protein kinase B，pAkt）水平，并增强高糖诱导的TORC1活性[15?16]。因此，miR?21可能通过抑制PTEN，激活PI3K?Akt?TORC1 信号通路而促进DN 时系膜细胞肥大及FN沉积。
miRNA与足细胞
尽管目前普遍认为肾小球系膜细胞的病理生理改变在DN的发生发展过程中起关键作用，然而近年来相关的研究表明，足细胞损伤也与DN，尤其是早期阶段DN密切相关。足细胞的受损导致大量蛋白尿，而蛋白尿的出现进一步加重足细胞及肾小球其他细胞的损伤，由此形成的恶性循环最终导致肾小球硬化的发生。
miR?29c：在2型糖尿病模型db/db小鼠的肾脏及高糖诱导的足细胞中，miR?29c 表达增加，而其靶基因Spry1蛋白减少。同时，通过质粒转染使足细胞miR?29c过表达可降低Spry1 蛋白水平而激活Rho 激酶。
Rho 激酶可通过多种途径最终引起足细胞凋亡及ECM 沉积。另外，通过反义寡核苷酸沉默miR?29c可显著降低db/db小鼠蛋白尿及ECM沉积。
miR?93：Long 等[19]的研究表明，另一种miRNA——miR?93 在2 型糖尿病模型db/db 小鼠的肾脏中表达降低，而其靶基因VEGF表达增加。
血管内皮生长因子（VEGF）作为与糖尿病微血管并发症相关的细胞因子，可作用于内皮细胞调控肾脏纤维化进程，而VEGF主要来源于足细胞。
研究发现，高糖状态下足细胞同样存在miR?93 下调及VEGF上调，提示糖尿病时，足细胞中miR?93 表达受到抑制，可能导致VEGF过表达而引起肾脏损伤。
miRNA与肾小管上皮细胞DN 小管间质病变包括肾小管上皮细胞损伤、肾间质炎性细胞浸润和肾间质纤维化。目前认为，肾间质ECM与肾间质的肌成纤维细胞（myofibroblast，MyoF）关系密切，而肾小管上皮细胞转分化是MyoF 的重要来源。
因此越来越多的证据表明，高糖状态下肾小管上皮细胞转分化为间充质细胞（epithelial?mesenchymal transition，EMT）的现象在糖尿病时肾脏纤维化过程中起到重要作用。
miR?192 及miR?215：广泛存在于各类上皮细胞的E?钙黏素（E?cadherin）是一类介导同种细胞互相黏附的钙依赖性跨膜糖蛋白。作为肾小管上皮细胞间紧密连接的重要成分，E-cadherin在保持肾小管上皮细胞完整性和极性中起重要作用，其表达缺失是肾小管上皮细胞转分化（EMT）的标志之一。
在TGF?β诱导的大鼠肾小管上皮细胞中，miR?192 及miR?215 表达减少，使E?cadherin 表达降低，最终促进EMT。由于ZEB2是E?cadherin的抑制蛋白之一，因此此过程可能与miR?192 及miR?215 减少对ZEB2的抑制有关。
miR -200a：作为miR-200 家族中的成员之一，miR-200a 在系膜细胞中受TGF?β调控而上调。在TGF-β诱导的大鼠近端小管上皮细胞中，miR-200a表达降低，与此同时，E?cadherin减少，而与纤维化程度相关的α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）上调，提示肾小管上皮细胞发生EMT，并导致ECM、FN及Col1的表达增加[23]。此过程与miR-200a上调SMAD3蛋白的活性有关。
3. miR?382：Kriegel 等通过miRNA 表达谱芯片检测发现，在人肾小管上皮细胞中，miR?382 受TGF?β调控而高表达。而将miR?382基因沉默后，可减弱TGF?β诱导的上皮细胞标志E-cadherin 的缺失。
超氧化物歧化酶2（SOD2）是miR?382的靶基因之一，在miR?382过表达时受到抑制。而通过质粒转染使人肾小管上皮细胞SOD2 基因过表达，可改善TGF?β诱导的E?cadherin 降低，抑制肾小管上皮细胞EMT过程。
结论与展望
近年来，miRNA 在疾病中作用的研究已成为了当前生命科学领域的研究热点，miRNA 通过对靶基因转录后的调控，使其在包括糖尿病在内的多种疾病中都发挥着重要作用。越来越多的研究也证实了miRNA 对DN 多条信号通路的调控作用。
在miRNA 的参与下，系膜细胞发生肥大，细胞外基质沉积，以及足细胞凋亡和肾小管上皮细胞转分化，共同参与了肾小球硬化的过程。
另一方面，miRNA 在不同细胞中发挥不同甚至相反的作用，体现了miRNA 调控的复杂性及细胞特异性。因此，有关miRNA与DN的分子作用机制仍有待进一步探索，对miRNA的深入研究及相关作用靶点的认识与探索，将为DN的早期诊断和治疗带来新的思路和方法。
因此，深入认识DN 的发病机制，并对其发病的关键环节进行干预，不仅可减轻疾病给患者带来的痛苦，对减轻国家在卫生经济费用方面的负担也有重要意义。
目前DN的发病机制仍未完全明确，近年有研究发现microRNA（miRNA）在基因中的调控作用可能成为DN一个新的诊断标志及治疗靶点。本文就miRNA在DN中的作用及相关机制进行综述。
miRNA的特点及作用机制
miRNA 是一种长约21～25 个核苷酸的非编码单链RNA。miRNA 与RNA 诱导的基因沉默复合物(RNA ?induced silencing complex，RISC)结合并形成非对称RISC复合物后被激活。
通过结合至靶基因mRNA 上，非对称RISC 复合物可促进mRNA 的降解或抑制mRNA 的翻译，从而抑制其靶基因的表达，实现对靶基因的转录后调控。
根据序列互补程度分类，目前已知的miRNA 对靶基因的负性调控作用主要通过两种方式：一种是miRNA 与靶基因mRNA 不完全互补。
此方式主要在翻译水平上抑制靶基因mRNA 的表达，并可影响mRNA 的稳定性，这类miRNA 的结合位点通常在靶基因mRNA 的3’端非翻译区，而绝大多数哺乳动物中的miRNA 通过这一方式发挥调控作用。
另一种是miRNA 与靶基因mRNA 完全互补。此方式可引起mRNA 的直接降解，这类miRNA 的结合位点通常都在靶基因mRNA的编码区或开放阅读框中。
据推测，人类基因组中3%为miRNA，而30%编码蛋白质的mRNA受其调控。由于miRNA在细胞增殖、分化及能量代谢方面起着重要作用，其异常表达可影响肿瘤、心血管疾病及代谢性疾病的发生发展。
随着miRNA在各种疾病发生机制中作用研究的深入，miRNA 在疾病中的诊断价值越来越受到重视，而基于miRNA 为靶点的基因治疗也展现出广阔的发展前景。
糖尿病肾病与miRNA
高血糖状态是DN 发生发展的关键环节，由高血糖引起的葡萄糖代谢异常及肾脏血流动力学改变是肾脏病变的基础，而各种细胞因子的激活则是病变的直接诱因。
其中，包括系膜细胞、足细胞及肾小球上皮细胞等肾脏多种细胞的损伤，均参与了肾小球硬化的过程。通过miRNA 表达谱芯片（microarray）及各种体内外实验发现，miRNA 在肾脏各种细胞损伤中起着不同作用。现将各种miRNA在高糖状态下不同细胞中的作用及相关机制分述如下。
miRNA与肾小球系膜细胞
目前认为，作为肾小球最主要的细胞之一——肾小球系膜细胞在高糖状态下的变化，即系膜细胞肥大及细胞外基质（ECM）沉积，是DN 最重要的特征。在此过程中，高糖诱导的转化生长因子β（TGF?β）升高是启动因素，并通过激活ERK1/2、PI3K 及JNK?MAP 激酶信号通路促进细胞肥大及胶原蛋白表达。
miR?192：Kato 等首次发现，在TGF?β诱导下的小鼠系膜细胞中，miR?192 的表达增高，而miR?192 可抑制锌指E盒结合蛋白1（zinc finger E?box binding homeobox 1，ZEB1）及锌指E 盒结合蛋白2（zinc finger E?box bindinghomeobox 2，ZEB2）的表达。
作为E?box 的抑制子，ZEB1/2的减少可引起E?box的上调，继而导致下游Ⅰ型胶原蛋白α2（type Ⅰ collagen α2，Col1α2）沉积。在STZ 诱导的1 型糖尿病小鼠以及2型糖尿病模型db/db小鼠的肾脏中也有同样结果。
miR-216a 及miR-217：E-box 作为一种重要的调控元件，可调控多种基因的表达。miR?216a及miR?217位于非编码RNARP23?298H6.1?001（RP23）的第二内含子上。E?box 的上调可促进miR?216a 及miR?217 的表达，继而下调磷酸酶张力蛋白同系物（phosphatase and tensinhomologue，PTEN），激活PI3K?Akt 信号通路。
Akt 激酶激活可通过使多种下游蛋白，包括TOR、GSK?3β及FoxO转录因子磷酸化而调控细胞生长、存活及蛋白质合成。这些转录因子的激活最终可引起系膜细胞肥大、氧化应激等而促进DN的进展。
此外，Kato等还发现，miR?216a可抑制Ybx1（一种Tsc?22 mRNA 结合蛋白），使Tsc?22 蛋白增加，促进TGF?β诱导的系膜细胞Col1α2的表达。
miR?200 家族：除了调控miR?216a 及miR?217 以外，E?box 的结合位点同时也存在于miR?200 家族（包括miR?141、?200a、?200b、?200c、?429）上游基因组区域，其上调可增加miR?200 家族的表达。
而miR?200 家族的增加可通过作用于下游蛋白Fog2，降低Fog2 对PI3K 的抑制，激活PI3K?Akt信号通路。
miR?377：在STZ 诱导1 型糖尿病小鼠及高糖状态下的人系膜细胞中，Wang 等也发现了miR?377 高表达。同时，在实验中证实了其通过下调锰超氧化物歧化酶（manganese superoxide dismutase，MnSOD）及p21 活化激酶（PAK1），增加纤连蛋白（FN）的表达。而FN是引起DN肾小球ECM沉积的主要蛋白之一。
miR?21：Dey 等研究发现，miR?21 在高糖培养的大鼠及人肾小球系膜细胞中高表达，而在OVE26 1 型糖尿病小鼠模型及UUO 肾间质纤维化大鼠模型中同样升高。与此同时，其靶基因PTEN 的表达减少，并伴有系膜细胞肥大，FN 增加。
miR?21 过表达可模拟高糖作用，抑制PTEN 表达，增加磷酸化丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶B（phospho? serine/ threonine protein kinase B，pAkt）水平，并增强高糖诱导的TORC1活性[15?16]。因此，miR?21可能通过抑制PTEN，激活PI3K?Akt?TORC1 信号通路而促进DN 时系膜细胞肥大及FN沉积。
miRNA与足细胞
尽管目前普遍认为肾小球系膜细胞的病理生理改变在DN的发生发展过程中起关键作用，然而近年来相关的研究表明，足细胞损伤也与DN，尤其是早期阶段DN密切相关。足细胞的受损导致大量蛋白尿，而蛋白尿的出现进一步加重足细胞及肾小球其他细胞的损伤，由此形成的恶性循环最终导致肾小球硬化的发生。
miR?29c：在2型糖尿病模型db/db小鼠的肾脏及高糖诱导的足细胞中，miR?29c 表达增加，而其靶基因Spry1蛋白减少。同时，通过质粒转染使足细胞miR?29c过表达可降低Spry1 蛋白水平而激活Rho 激酶。
Rho 激酶可通过多种途径最终引起足细胞凋亡及ECM 沉积。另外，通过反义寡核苷酸沉默miR?29c可显著降低db/db小鼠蛋白尿及ECM沉积。
miR?93：Long 等[19]的研究表明，另一种miRNA——miR?93 在2 型糖尿病模型db/db 小鼠的肾脏中表达降低，而其靶基因VEGF表达增加。
血管内皮生长因子（VEGF）作为与糖尿病微血管并发症相关的细胞因子，可作用于内皮细胞调控肾脏纤维化进程，而VEGF主要来源于足细胞。
研究发现，高糖状态下足细胞同样存在miR?93 下调及VEGF上调，提示糖尿病时，足细胞中miR?93 表达受到抑制，可能导致VEGF过表达而引起肾脏损伤。
miRNA与肾小管上皮细胞DN 小管间质病变包括肾小管上皮细胞损伤、肾间质炎性细胞浸润和肾间质纤维化。目前认为，肾间质ECM与肾间质的肌成纤维细胞（myofibroblast，MyoF）关系密切，而肾小管上皮细胞转分化是MyoF 的重要来源。
因此越来越多的证据表明，高糖状态下肾小管上皮细胞转分化为间充质细胞（epithelial?mesenchymal transition，EMT）的现象在糖尿病时肾脏纤维化过程中起到重要作用。
miR?192 及miR?215：广泛存在于各类上皮细胞的E?钙黏素（E?cadherin）是一类介导同种细胞互相黏附的钙依赖性跨膜糖蛋白。作为肾小管上皮细胞间紧密连接的重要成分，E-cadherin在保持肾小管上皮细胞完整性和极性中起重要作用，其表达缺失是肾小管上皮细胞转分化（EMT）的标志之一。
在TGF?β诱导的大鼠肾小管上皮细胞中，miR?192 及miR?215 表达减少，使E?cadherin 表达降低，最终促进EMT。由于ZEB2是E?cadherin的抑制蛋白之一，因此此过程可能与miR?192 及miR?215 减少对ZEB2的抑制有关。
miR -200a：作为miR-200 家族中的成员之一，miR-200a 在系膜细胞中受TGF?β调控而上调。在TGF-β诱导的大鼠近端小管上皮细胞中，miR-200a表达降低，与此同时，E?cadherin减少，而与纤维化程度相关的α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）上调，提示肾小管上皮细胞发生EMT，并导致ECM、FN及Col1的表达增加[23]。此过程与miR-200a上调SMAD3蛋白的活性有关。
3. miR?382：Kriegel 等通过miRNA 表达谱芯片检测发现，在人肾小管上皮细胞中，miR?382 受TGF?β调控而高表达。而将miR?382基因沉默后，可减弱TGF?β诱导的上皮细胞标志E-cadherin 的缺失。
超氧化物歧化酶2（SOD2）是miR?382的靶基因之一，在miR?382过表达时受到抑制。而通过质粒转染使人肾小管上皮细胞SOD2 基因过表达，可改善TGF?β诱导的E?cadherin 降低，抑制肾小管上皮细胞EMT过程。
结论与展望
近年来，miRNA 在疾病中作用的研究已成为了当前生命科学领域的研究热点，miRNA 通过对靶基因转录后的调控，使其在包括糖尿病在内的多种疾病中都发挥着重要作用。越来越多的研究也证实了miRNA 对DN 多条信号通路的调控作用。
在miRNA 的参与下，系膜细胞发生肥大，细胞外基质沉积，以及足细胞凋亡和肾小管上皮细胞转分化，共同参与了肾小球硬化的过程。
另一方面，miRNA 在不同细胞中发挥不同甚至相反的作用，体现了miRNA 调控的复杂性及细胞特异性。因此，有关miRNA与DN的分子作用机制仍有待进一步探索，对miRNA的深入研究及相关作用靶点的认识与探索，将为DN的早期诊断和治疗带来新的思路和方法。
（注：转载时请注明复诊网）
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